Історія церкви Святого Духа нерозривно пов'язана з іменем могутньої правительки Османської імперії — Роксолани. Згідно з переказами, саме в церкві Святого Духа у Рогатині був священиком отець Лука Лісовський, який пізніше був похований біля неї. Сама ж Роксолана отримала в Святодухівській церкві своє перше причастя. При церкві діяло одне з найстаріших в Україні церковних братств, коштами якого створено унікальний ренесансно-бароковий іконостас, що датується 1650 р. та є одним з трьох найстаріших, збережених до нашого часу, іконостасів України.
Експозиція музею нараховує 134 експонати. Тут представлені унікальні твори іконопису. Зокрема, одна з найдавніших із збережених в Україні ікон — "Іоанн Хреститель з житієм" (1520), а також ікони іконостасу кін. XVI ст. Для огляду пропонуються також стародруки, дерев'яні скульптури та вироби з каменю, що мають церковне призначення.
Сьогодні церква-музей є частиною музейного комплексу міста Рогатин, який було створено 2004 р.